單層培養(yǎng)的細(xì)胞系在進(jìn)行原代培養(yǎng)時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和細(xì)胞的不斷分裂，一則細(xì)胞之間相互接觸而發(fā)生接觸抑制，生長(zhǎng)速度減慢甚至停止；另一方面由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡、代謝廢棄物不斷積累，導(dǎo)致細(xì)胞停止生長(zhǎng)甚至死亡。此時(shí)，為獲得大量的、穩(wěn)定的同種細(xì)胞，并保證細(xì)胞始終維持快速生長(zhǎng)，可以將單層細(xì)胞從培養(yǎng)基質(zhì)上分離下來(lái)制成單細(xì)胞懸液，按照推薦濃度接種到若干個(gè)新的培養(yǎng)器皿內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，這個(gè)過(guò)程就稱(chēng)為傳代（Passage）或再培養(yǎng)（Subculture）。

 

單層細(xì)胞傳代培養(yǎng)，需要將細(xì)胞間及細(xì)胞與培養(yǎng)基質(zhì)之間的連接打斷。對(duì)于某一些松散貼壁的細(xì)胞類(lèi)型，只需輕敲培養(yǎng)器皿側(cè)面，細(xì)胞就會(huì)脫離下來(lái)。絕大多數(shù)貼壁細(xì)胞需要使用蛋白水解酶例如，trypsin/EDTA消化破壞上述連接。還有少數(shù)細(xì)胞需要使用機(jī)械力，例如使用細(xì)胞刮，使細(xì)胞分離下來(lái)。對(duì)單層培養(yǎng)而言，細(xì)胞生長(zhǎng)接近指數(shù)生長(zhǎng)期末時(shí)（大約70%-90%匯合），即可進(jìn)行傳代。一般生長(zhǎng)穩(wěn)定的細(xì)胞4~7天傳代一次。

 

單層培養(yǎng)傳代步驟：

 

1. 事先將培養(yǎng)基、Trypsin-EDTA溶液、Trypsin中和液、DPBS在室溫平衡，并準(zhǔn)備若干已包被好poly-L-lysine或Fibronectin等的培養(yǎng)器皿。

 

注：不推薦使用37℃水浴鍋對(duì)上述溶液進(jìn)行平衡。

 

2. 將長(zhǎng)滿細(xì)胞的培養(yǎng)器皿中原有培養(yǎng)液吸棄，DPBS洗滌細(xì)胞1-2次。

 

3. 加入適量（略蓋過(guò)細(xì)胞即可）Trypsin-EDTA溶液室溫孵育0.5-2 min，不定時(shí)在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，直至約80%細(xì)胞收縮、變圓突起（round up），立即加入等體積Trypsin中和液終止消化。

 

注：不同類(lèi)型細(xì)胞消化時(shí)間長(zhǎng)短不一，佳消化時(shí)間需自行摸索。

 

4. 輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)容器使細(xì)胞脫離，并將消化下來(lái)的細(xì)胞收集、轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)。另取適量*培養(yǎng)基潤(rùn)洗培養(yǎng)容器，將殘留的細(xì)胞一并轉(zhuǎn)移至離心管。

 

注：細(xì)胞收集完畢后，可以在顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器內(nèi)還有多少細(xì)胞殘留（通常應(yīng)少于5%），以此判斷細(xì)胞收獲是否*。 

 

5. 將收獲的細(xì)胞懸液于1000rpm下離心5min，棄上清，然后用適量*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

 

6. 計(jì)數(shù)細(xì)胞，然后根據(jù)推薦的接種密度重新接種到新的已包被好的培養(yǎng)皿內(nèi)。將培養(yǎng)器皿置于37℃, 5% CO2/95% air培養(yǎng)箱培養(yǎng)，視細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每隔2-3天換一次液，詳見(jiàn)datasheet。

 

注：有限細(xì)胞系的增殖速率較低，其原代培養(yǎng)通常以1:1，1:2或1:3的比例進(jìn)行傳代，但是對(duì)于增殖速率很高的連續(xù)細(xì)胞系（或無(wú)限細(xì)胞系），通常要以更高的比例進(jìn)行傳代。